Kanapių augalų audinių kultūra: kas tai?

• 1. Audinių kultūros istorija
• 2. Audinių kultūros pagrindai
• 3. Kas yra augalų audinių kultūra ir kaip ji veikia?
• 4. Audinių kultūra vs. klonavimas
• 4. a. Klonavimas
• 4. b. Augalo audinių kultūra
• 5. 5 audinių kultūros žingsniai
• 5. a. Kaip atlikti audinių kultūrą namuose
• 5. b. Cheminės sudėties gairės
• 6. Apibendrinimas

Audinių kultūra – tai procesas, kurio metu iš augalo paimamas gyvas audinys ir steriliose sąlygose iš jo auginamas pilnavertis augalas. Šis procesas atsirado dar 1885 m., o kanapių sėkloms kanapių sėklos jis yra ganėtinai naujas, tačiau labai efektyvus ir taikomas daugeliui augalų rūšių. Audinių kultūros proceso metu gaunamas stabilizuotas augalo audinys, kurį specialistai gali išlaikyti daugindami augalų ląsteles. Laikant šį genetinį medžiagą švarioje ir saugioje aplinkoje, galima nuolat dauginti konkrečius augalų kultivarus ir fenotipus. Ši technika leidžia išsaugoti retas augalų rūšis, arba palaikyti produktyviausius bei stipriausius fenotipus, kad būtų galima juos naudoti vėliau, daugindami lauke ar viduje. Audinių kultūras galima įsivaizduoti kaip „genetikos bankus“, kur augalai laikomi specialiomis sąlygomis tol, kol prireikia juos perkelti į indus arba į lauką.

1. Audinių kultūros istorija

Audinių kultūros istorija prasideda 1885 m., kai vokiečių zoologas bandė auginti audinį iš vištos embriono, tačiau tik 1907 m. amerikiečių zoologas sėkmingai pavyko išauginti varlės nervinę ląstelę.

Vėliau, 1910 m. prancūzų chirurgas patobulino šią techniką ir apibrėžė kas yra audinių kultūra. Po technikos įtvirtinimo, daugelyje kitų eksperimentų pavyko išauginti kamienines ląsteles dirbtinėmis sąlygomis, kas ženkliai praplėtė žinias apie žmogaus biologiją bei suteikė proveržį regeneracinėje medicinoje. Bet galite klausti – o kaip tai siejasi su kanapėmis?

2. Audinių kultūros pagrindai

Prieš gilindamiesi, kaip veikia audinių kultūra ir kuo ji skiriasi nuo klonavimo, susipažinkime su pagrindais.

Tyrimai

Jei norite išbandyti audinių kultūrą namuose, pirmiausia atlikite tyrimą, ar ši technika buvo sėkmingai pritaikyta būtent tam strain’ui, kad galėtumėte vadovautis patikrintu metodu ir žinotumėte ką daryti ir ko vengti.

Augalo audinys

Dabar, kai žinote, kuo vadovautis, sekantis žingsnis – atrasti augalą, kurį naudosite audinių kultūros procese. Donorinis augalas turi būti visiškai sveikas ir be ligų. Taip pat, nuo ko imsite audinį, priklauso nuo konkretaus augalo, todėl laikykitės anksčiau paminėtų rekomendacijų, kad padidintumėte sėkmės tikimybę. Šis procesas remiasi švara, todėl užtikrinkite, kad viskas – tiek drabužiai, medžiagos, tiek patalpa – būtų kruopščiai sterilizuoti, nes užkrėtimas yra dažniausia nesėkmės priežastis.

Oro švara

Kitas žingsnis – oras, nes augalams reikalingas švarus oras. Tam galite įsigyti improvizuotą pirštinę dėžę arba pasigaminti ją iš akvariumo, PVC vamzdžių ir pan.

Terpė

Viena svarbiausių audinių kultūros dalių yra terpė, kurioje bus dedamas augalas, kai tik užtektinai paaugs. Terpė turėtų būti želė konsistencijos, užtikrinanti atramą šaknims ir augimui bei aprūpinanti augalą maistinėmis medžiagomis, reikalingomis augti. Todėl viena populiariausių terpių – Agar.

Dabar, kai jau žinote, ko reikia, skaitykite toliau ir sužinokite, kaip daryti kanapių ir kitų augalų audinių kultūrą. Prisiminkite, jog audinių kultūra reikalauja tinkamų medžiagų ir įrangos, bet nėra ko nerimauti – visada galite klonuoti savo augalus! Nors klonų skaičius priklauso nuo šakų skaičiaus, tai daug lengvesnis būdas ir nereikalauja daug patirties – pakanka klonavimo gelio ir žirklių!

3. Kas yra augalų audinių kultūra ir kaip ji veikia? 

Audinių kultūra – tai būtent tai, kas aprašyta aukščiau: užtenka paimti kelis augalų audinių gabalėlius ar ląsteles ir iš jų išauginti šimtus ar net tūkstančius identiškų klonų. Šis metodas leidžia augintojams išsaugoti norimą strain‘ą praktiškai neribotai, užimant minimaliai vietos ir reikalaujant nedaug pastangų. Kaip ir įprastas klonavimas, audinių kultūra pradedama nuo nedidelės dalies augalo, tačiau skirtingai nei įprasto klonavimo atveju, audinys apkarpomas, sterilizuojamas, ir tik tada keliauja į maistinių medžiagų terpę, kurioje yra ne tik maistingųjų medžiagų, bet ir hormonų bei cukraus.

Ši maistinių medžiagų terpė yra ruošiamasi kiekvienam audinių kultūros atvejui individualiai, nes tam tikri maistingieji elementai ir hormonai aktyvuoja norimą augimo stadiją. Pvz., jei norite aktyvuoti šaknų vystymąsi ir/arba masinį dauginimąsi, naudokite specifinę maistinę terpę. Kai audinys pakankamai didelis, jį galima padalinti į šimtus atskirų dalių, kurias galima klonuoti atskirai – jei to siekiate. Pakankamai išaugus, šie gabalėliai gaus specialią terpę, skatinančią įsišaknijimą ir vėliau augimą.

4. Audinių kultūra vs. klonavimas

Kanapių industrijai augant, komerciniai augintojai ieško būdų, kaip per trumpesnį laiką gauti didesnį derlių ir stipresnį poveikį. Kai įmanoma, vietoj klonavimo jie renkasi audinių kultūrą – bet kodėl?

Klonavimas 

Kaip turbūt žinote, klonavimas – tai augalo ūglių nupjovimas ir laukimas, kol jie įsišaknys, tada šis klonas tampa tiksli motininio augalo kopija.

Tačiau klonai gali būti nepatikimi kaip daigai, nes išgyvenamumas gali būti nedidelis, jie jautrūs kenkėjams, infekcijoms, ligoms, o laikui bėgant didėja genetinių mutacijų tikimybė. Na, o audinių kultūroje viskas kitaip.

Augalo audinių kultūra

Audinių kultūros procesas ganėtinai paprastas, tačiau reikia daug kontrolės, kad išlaikytumėte tinkamas sąlygas, todėl laboratorijose reikia:

Sterilizacija

Audinių kultūra reikalauja idealių sąlygų augalų augimui, tačiau tokioje terpėje puikiai dauginasi ir bakterijos, todėl būtina viską sterilizuoti. Tai ypač svarbu, nes grybai ar bakterijos gali pražudyti jūsų augalus, todėl ne tik laboratorija turi būti sterili, bet ir visi įrankiai, įranga ir patys augalų audiniai (dar vadinami „eksplantais“).

Asepinė aplinka  

Visas procesas turi vykti visiškai sterilioje aplinkoje, tad idealiu atveju tam sukuriama speciali kamera, kurioje rankomis liečiate jau sterilizuotą įrangą. Ši aplinka naudojama kiekvieną kartą, kai reikia kažką (įrankius, įrangą ar audinius) priliesti prie oro.

Ligos lengvai patenka į darbo vietas – grybelinės sporos visada aplink mus. Siekiant apsaugoti in vitro augalus (augančius tokiose talpose kaip Petri lėkštelės), specialistai dažnai dirba šalia arba po srauto gaubtais. Šie įrenginiai ventiliatoriaus pagalba išpučia orą per HEPA filtrą – įrenginį, kuris pašalina itin smulkius teršalus iš oro, pvz., virusus, bakterijas ar grybelių sporas. Švarus oras taip pat papildomai izoliuoja darbo zoną, kad dulkės nenukristų ant atvirų indų.

Speciali auginimo terpė

Audinių kultūrai reikia sterilios terpės, kuri augalui suteiktų maistingųjų medžiagų, cukraus, vandens ir vietos augti. Šią terpę galima pasigaminti namuose iš jau paruoštų miltelių, cukraus ir distiliuoto vandens, pH turi būti 5,8. Nors procesas paprastas, būtina vadovautis atsargumo reikalavimais.

5. 5 audinių kultūros žingsniai

Čia pateikiami 5 paprasti audinių kultūros žingsniai laboratorijoje – atkreipkite dėmesį, kad tai santrauka viso proceso.

1. Pasirinkite norimą augalą;
2. Patalpinkite audinį į sterilią aplinką, nupjaukite dalį, nuvalykite ją ir auginkite tinkamoje terpėje;
3. Užtikrinkite tinkamas sąlygas ir laukite, kol audinys dauginsis (dažniausiai užtrunka 14 dienų);
4. Skatinkite šaknų susiformavimą;
5. Perkelkite į galutinę talpą ir auginkite toliau.

Jei norite detalesnio žingsnis po žingsnio aprašymo, kaip tai atlikti namuose, štai gidas – tačiau turėkite omenyje, kad tam reikia ir brangesnės įrangos, todėl net ir „pasidaryk pats“ atveju reikalinga speciali technika.

Kaip atlikti audinių kultūrą namuose

Jei domina išsamus kanapių audinių kultūros gidas, štai žingsnis po žingsnio aprašymas – kaip minėta, reikės specialios įrangos, tačiau tai visiškai įmanoma daryti namuose.

Iniciavimo fazė (1–2 savaitės)

1 žingsnis

Įjunkite srauto gaubtą ir palikite veikti bent 30 min. prieš pradėdami. Jei gaubto neturite, naudokite alkoholio degiklį ar lempą ir dirbkite arti liepsnos.

2 žingsnis

Sterilizuokite srauto gaubtą su 70% etanoliu, bet nepurkškite tiesiai ant filtro.

3 žingsnis

Įjunkite sterilizatorių ir leiskite jam įkaisti 20 min.

4 žingsnis

Sterilizuokite popieriaus paketą sausuoju ciklu, tada lėtai sterilizuokite indus, vandenį ir tween.

5 žingsnis

Terpei paruošti paimkite indą, užpildykite jį osmosiniu, distiliuotu arba dejonizuotu vandeniu (geriausia). Jei ruošiate 1 l terpės, įpilkite 900 ml vandens. Į vandenį įpilkite Grow trąšų iki EC sieks 1,5, tada įberkite 30 g/l cukraus ir sureguliuokite pH iki 5,7. Įpilkite 6 g/l agar, supilkite į sterilizuojamą butelį, bet neperkraukite. Sterilizuokite butelį 15 min ir paskirstykite po ~50 ml į kiekvieną sterilizuotą indą.

6 žingsnis

Turėdami terpę, pasiruoškite tirpalą su 0,5% balikliu ir 0,1% steriliu tween 20; jei turite tik 2,75% baliklio, įpilkite 181 ml 1 l vandens.

7 žingsnis

Į indą įpilkite truputį vandens, įdėkite kanapės medžiagą ir įsitikinkite, kad ji sveika. Jei medžiagą laikysite daugiau nei 1 val., įdėkite ją į šaltkrepšį su ledu ir kuo greičiau pamerkite į vandenį.

8 žingsnis

Pasiimkite sterilų uždarytą indą, užpildykite apie 80% baliklio/tween tirpalu, sudėkite augalinę medžiagą ir uždarykite indą.

9 žingsnis

Švelniai suplakite 20 min, tada po pradinio laiko intensyviai suplakite 20 sek.

10 žingsnis

Perkelkite augalą į kitą indą su 80% sterilizuoto vandens, švelniai suplakite 5 min ir pakartokite dar 2 kartus.

11 žingsnis

Steriliais pincetais perkelkite augalo medžiagą ant sterilaus popieriaus, kad sugertų vandenį, ir įdėkite po vieną gabalėlį į kiekvieną indą. Augalas turi būti vertikaliai inde, tada padėkite ant lentynėlės 25°C temperatūroje ir 18/6 šviesos režime mažiausiai 3 savaites. Kai augalai bus pasiruošę, sėkmingai užauginsite kloną ir jis bus pasirengęs augti jūsų pasirinktoje terpėje, tiek lauke, tiek viduje.

Cheminės sudėties gairės 

Atkreipkite dėmesį, kad yra kelių tipų terpės, o mineralų tipai ir kiekiai gali skirtis pagal pasirinktą terpę. Šis gidas parašytas naudojant Murashige-Skoog terpę kaip pavyzdį, tad būtinai išsiaiškinkite, kokios sudedamosios dalys ir kiekiai yra geriausi jūsų naudojamai terpei.

Šie esminiai elementai reikalingi jūsų kanapių augalams dideliais kiekiais audinių kultūroje – be jų augalai neišaugs žaliąją masę.

Šių elementų jūsų kanapėms reikia mažesniais kiekiais, bet jie taip pat būtini audinių kultūrai – be jų augalai negalės augti tinkamai ir pasireikš trūkumo požymiai.

Šie vitaminai yra būtini, kad palaikytų jūsų augalo metabolizmą, ypač audinių kultūros procese, todėl pasirūpinkite tinkamais kiekiais.

6. Apibendrinimas

Kanapių audinių kultūra gali atrodyti sudėtinga, bet iš tiesų ji yra gana paprasta – svarbiausia palaikyti optimalias sąlygas ir imtis visų saugumo priemonių, kad išgyvenamumas būtų didžiausias. Ši technika gana nauja ir gali būti brangi, todėl ne visi augintojai turi reikalingą įrangą, bet jei dirbate ar turite savo audinių kultūros laboratoriją namuose, pasidalinkite patirtimi su bendraminčiais komentaruose!

Išoriniai šaltiniai

1. Augalų audinių kultūros. - Kärkönen, Anna & Santanen, Arja & Iwamoto, Kuninori & Fukuda, Hiroo. (2020). 
2. Nanotechnologijos ir augalų audinių kultūra. - Tariq, Amina & Ilyas, Saiqa & Naz, Shagufta. (2020). 
3. Augalų audinių kultūros terpės. Pastarieji in vitro kultūrų pokyčiai. - Annarita Leva ir Laura M. R. Rinaldi (2012).