Tkáňová kultivace konopí: Co to je?

• 1. Historie tkáňové kultivace
• 2. Základy tkáňové kultivace
• 3. Co je rostlinná tkáňová kultivace a jak funguje?
• 4. Tkáňová kultivace vs. klonování
• 4. a. Klonování
• 4. b. Rostlinná tkáňová kultivace
• 5. Pět kroků tkáňové kultivace
• 5. a. Jak provést tkáňovou kultivaci konopí doma
• 5. b. Průvodce chemickým složením
• 6. Závěr

Tkáňová kultivace spočívá v odebrání živé tkáně z rostliny a pěstování této tkáně do celé rostliny ve sterilních podmínkách. Tento proces pochází z roku 1885 a u semen konopí je relativně novinkou, avšak je velmi efektivní a lze jej použít u většiny rostlinných druhů. Proces tkáňové kultivace vede ke stabilizovanému zdroji rostlinné tkáně, kterou mohou techničtí pracovníci uchovat díky množení rostlinných buněk. Tím, že uchovávají tuto genetickou zásobu v čistých a bezpečných prostorách, mohou dlouhodobě uchovávat a nadále rozmnožovat specifické odrůdy a fenotypy rostlin. Tato technika nakonec pomáhá zachovat vzácné rostliny nebo uchovat produktivní a silné fenotypy živé a zdravé pro další použití na poli při množení. Na tkáňovou kultivaci můžete nahlížet jako na „banku“ genetiky, která je uchovávána ve speciálních podmínkách, dokud není potřeba je přesadit do květníků nebo přímo na venkovní záhon.

1. Historie tkáňové kultivace

Historie tkáňové kultivace sahá do roku 1885, kdy se německý zoolog pokusil kultivovat tkáň z embrya kuřete, ale až v roce 1907 se americkému zoologovi podařilo úspěšně kultivovat nervovou buňku žáby.

Později, v roce 1910, francouzský chirurg tento postup vylepšil a definoval pojem tkáňová kultivace, a po jeho zavedení následovalo několik dalších úspěšných experimentů, které umožnily ostatním výzkumníkům pěstovat kmenové buňky v umělých podmínkách. To přineslo více poznatků o lidské biologii a výrazný posun v regenerativní medicíně. Ale možná si říkáte – Jak se to týká konopí?

2. Základy tkáňové kultivace

Než se pustíme hlouběji do tkáňové kultivace, jejího fungování a rozdílů mezi tkáňovou kultivací a klonováním, pojďme si projít základy tkáňové kultivace.

Výzkum

Pokud chcete vyzkoušet tkáňovou kultivaci doma, první věcí je zjistit, zda ji někdo s daným kmenem již úspěšně provedl, abyste mohli postupovat podle stejných kroků a případně je využít jako návod, co dělat a čeho se vyvarovat.

Rostlinná tkáň

Nyní, když víte, na co navázat, je třeba získat rostlinu, kterou použijete k tkáňové kultivaci. Rostlina dárce by měla být 100% zdravá a bez chorob. Záleží také na tom, jakou část rostliny budete používat, protože to se liší podle druhu, proto se ujistěte, že dodržujete doporučené postupy pro zvýšení úspěšnosti. Pamatujte, že tento proces spoléhá na čisté prostředí, proto je nutné, aby vše bylo čisté a sterilizované – včetně oblečení, pomůcek, ale i místnosti samotné, protože nejčastějším důvodem selhání je kontaminace.

Vzduch

Dalším krokem je vzduch, protože rostliny potřebují čistý vzduch; k jeho zajištění si můžete koupit improvizovanou „glove box“ nebo si ji vyrobit například z akvária a PVC trubek.

Médium

Jednou z nejdůležitějších částí tkáňové kultivace je médium, neboť právě tam bude rostlina umístěna, jakmile dostatečně vyroste. Toto médium by mělo být gelové struktury, aby poskytovalo stabilitu a oporu pro vývoj kořenů i růst rostliny, a zároveň živiny pro tvorbu energie, proto je jedním z nejpopulárnějších medií Agar.

Nyní, když už víte, co je potřeba, pokračujte ve čtení a pochopíte, jak tkáňově kultivovat rostliny konopí nebo i jiné rostliny. Pamatujte, že pokud nemáte správné vybavení a materiál, může být tkáňová kultivace náročná, ale není třeba si dělat starosti. Rostliny můžete vždy také naklonovat; i když množství klonů závisí na počtu větví vaší rostliny, je to mnohem jednodušší a nevyžaduje tolik zkušeností – stačí klonovací gel a nůžky a je hotovo!

3. Co je rostlinná tkáňová kultivace a jak funguje? 

Tkáňová kultivace přesně odpovídá předchozímu popisu: v podstatě získáte jen pár kousků rostlinné tkáně nebo buněk a vypěstujete stovky až tisíce identických klonů. Tato metoda umožňuje pěstitelům uchovávat určitou genetickou odrůdu téměř navěky při minimální potřebě prostoru a úsilí. Stejně jako u běžného klonování začínáte s malou částí rostliny, kterou chcete klonovat, oproti běžnému klonování se však tato vzorka ořezává, sterilizuje a poté, co je čistá, umisťuje se do kultivačního média, které obsahuje nejen živiny, ale také hormony a cukry.

Toto živné médium je v podstatě připravováno na míru každé tkáňové kultivaci, protože určité živiny a hormony vyvolávají různé fáze vývoje; pokud chcete podpořit růst, tvorbu kořenů a/nebo množení (pokud je rostlina již dostatečně velká), musíte zajistit konkrétní kultivační médium pro požadovaný typ vývoje. Takže v zásadě získáte kousek tkáně, a když je dostatečně velký, můžete ho rozdělit na stovky úlomků a klonovat jednotlivě, pokud si to přejete. Jakmile jsou tyto tkáně dostatečně velké pro další růst, dostanou živné médium, které je podpoří v zakonřenění a následně růstu.

4. Tkáňová kultivace vs. klonování

Jak se konopný průmysl vyvíjí, komerční pěstitelé hledají nejlepší způsoby, jak dosáhnout větších výnosů a vyšší potence v kratším čase. Pokud je to možné, přecházejí od klonování k tkáňové kultivaci. Ale proč?

Klonování 

Jak už možná víte, klonování spočívá v odebrání řízků z rostliny a čekání, dokud se nevyvinou kořeny, abyste mohli řízek vypěstovat – klon se stane přesnou kopií mateční rostliny.

Klonům však lze často méně důvěřovat než semenáčkům, protože je obtížné zajistit vysokou úspěšnost přežití a navíc jsou náchylné na škůdce, infekce, nemoci a s narůstajícími generacemi hrozí vznik genetických mutací. S tkáňovou kultivací je to ale jiné.

Rostlinná tkáňová kultivace

Proces tkáňové kultivace je poměrně jednoduchý, ale vyžaduje velkou kontrolu pro zajištění správných podmínek, laboratoře pro tkáňovou kultivaci musejí splňovat:

Sterilizace

Tkáňová kultivace vyžaduje ideální prostředí pro růst rostlin, takže toto prostředí by mělo poskytovat vše, co rostlina potřebuje v dobře vstřebatelné formě. Ale stejné prostředí je rovněž ideální pro bakterie a škodlivé mikroorganismy, proto je nutné vše sterilizovat. Tato sterilizace je zásadní, protože houby nebo bakterie mohou vaše rostliny zahubit, proto musí být sterilizovaná nejen laboratoř, ale také nástroje, vybavení i samotná rostlinná tkáň (tzv. „explantát“).

Aseptické prostředí  

Je nezbytné provádět celý proces ve zcela sterilním prostředí, v ideálním případě se vytvoří speciální komora, kde můžete manipulovat s již sterilním vybavením. Toto speciální prostředí se používá vždy, když je potřeba cokoliv – nástroje, vybavení nebo tkáň – vystavit vzduchu.

Choroby se do pracovních prostor mohou velmi snadno dostat – v našem okolí jsou totiž spory plísní rozptýleny ve vzduchu neustále. Aby se předešlo kontaminaci in vitro rostlin (těch, které rostou ve skle, např. Petriho miskách), technici často pracují před nebo pod tzv. laminárním boxem. Toto zařízení využívá ventilátory, které foukají vzduch přes HEPA filtr – vybavení schopné zachytit i ty nejmenší částečky, jako jsou viry, bakterie a spory plísní. Takto očištěný vzduch proudí přes pracovní prostor v laminárním toku, což brání usazování částic na otevřených miskách.

Speciální růstové médium

Při tkáňové kultivaci je připraveno sterilní médium, které dodá rostlině živiny, cukr, vodu a místo k růstu, poskytuje tedy vše potřebné pro přežití, než se z ní stane kompletní rostlina. Toto médium lze připravit doma z hotového prášku, cukru a destilované vody s hodnotou pH 5,8. I když to vypadá jednoduše, je potřeba dbát zvýšené opatrnosti.

5. Pět kroků tkáňové kultivace

Zde je 5 jednoduchých kroků rostlinné tkáňové kultivace v laboratoři, mějte na paměti, že jde o shrnutí celého procesu.

1. Vyberte rostlinu, kterou chcete použít;
2. Vložte tkáň do sterilního prostředí, odeberte jeden kousek, očistěte ho a nechte růst ve vhodném médiu;
3. Zajistěte správné podmínky a nechte tkáň rozmnožit (zpravidla trvá 14 dní);
4. Přinuťte rostlinu zakořenit;
5. Přesaďte do finální nádoby a nechte růst.

Pokud chcete podrobnější krok za krokem i domácí variantu, zde je průvodce – nezapomeňte však, že budete potřebovat drahé vybavení, takže i když je to DIY, je třeba speciální vybavení.

Jak provést tkáňovou kultivaci konopí doma

Pokud hledáte postup, jak provádět tkáňovou kultivaci u konopí doma, zde je podrobný návod; jak už bylo řečeno, budete potřebovat speciální vybavení, ale lze to zvládnout i v domácích podmínkách.

Fáze zahájení (1-2 týdny)

Krok 1

Zapněte laminární box a nechte ho běžet alespoň 30 minut před zahájením, pokud laminární box nemáte, použijte lihový kahánek/lampu a pracujte v blízkosti plamene.

Krok 2

Sterilizujte plochu laminárního boxu 70% ethanolem, ale nestříkejte přímo na filtr.

Krok 3

Zapněte sterilizátor a nechte ho zahřívat 20 minut.

Krok 4

Sterilizujte balíček papíru na suchém cyklu, poté sterilizujte nádoby, vodu a tween na pomalém cyklu.

Krok 5

Pro přípravu média vezměte nádobu a naplňte ji reverzně osmózovanou, destilovanou nebo deionizovanou vodou (ideální). Pokud připravujete 1l média, přidejte 900 ml vody. Poté přidejte růstové živiny, dokud nedosáhnete EC 1,5, přidejte 30 g/l cukru a upravte pH roztoku na 5,7, potom přidejte 6g/l agaru a vložte směs do autoklávovatelné láhve, ale NEPŘEPLŇUJTE ji. Sterilizujte láhev 15 minut, poté rozlijte zhruba 50 ml do každé sterilizované nádoby.

Krok 6

Nyní máte připravené médium. Připravte si roztok s 0,5% chlóru a 0,1% sterilního tweenu 20. Máte-li pouze 2,75% chlór, přidejte 181 ml na 1l.

Krok 7

Naplňte nádobu malým množstvím vody, vezměte materiál z konopí a vložte ho do vody, ujistěte se, že tento materiál je zdravý. Pokud jej skladujete déle než 1 hodinu, dejte jej do chladicího boxu s ledem a vložte jej do vody co nejdříve.

Krok 8

Vezměte uzavíratelnou sterilizovanou nádobu, naplňte ji z 80 % roztokem chlóru/tweenu, přidejte rostlinný materiál a uzavřete.

Krok 9

Jemně protřepávejte 20 minut a poté prudce protřepte po dobu 20 sekund po uplynutí 20 minut.

Krok 10

Přeneste rostlinný materiál do další nádoby naplněné z 80 % sterilizovanou vodou, opět jemně protřepávejte 5 minut a opakujte ještě 2x.

Krok 11

Použijte sterilní pinzetu pro přemístění rostlinného materiálu na sterilní papír pro odsátí přebytečné vody, a poté vložte jeden kousek materiálu do každé nádoby. Rostlina by měla stát vzpřímeně v nádobě a tu potom dejte na polici při 25 °C pod 18/6 světelným cyklem minimálně 3 týdny. Po úspěšném růstu vašeho klonu je připraven k dalšímu pěstování v jakémkoliv médiu, ať už venku nebo uvnitř.

Průvodce chemickým složením 

Mějte na paměti, že existují různé typy médií, minerály a jejich množství se liší podle použitého typu; tento návod vychází z média Murashige-Skoog jako příkladu, proto doporučujeme zjistit, jaké složky a v jakém množství jsou vhodné pro médium, které používáte.

Jde o základní živiny, které vaše rostliny konopí potřebují ve velkém množství a jsou zásadní pro tkáňovou kultivaci, bez nich rostliny neporostou do zelené hmoty.

Tyto živiny jsou pro zdraví konopí potřebné v menším množství, ale jsou také zásadní pro tkáňovou kultivaci. Bez nich vaše rostliny neporostou správně a určitě se projeví příznaky nedostatku.

Tyto vitamíny jsou nezbytné pro metabolismus vašich rostlin, obzvláště při tkáňové kultivaci, proto je nutné je dodat ve správném množství.

6. Závěr

Tkáňová kultivace konopí může na první pohled působit složitě, ale ve skutečnosti je relativně jednoduchá – stačí dodržovat optimální podmínky a veškerá bezpečnostní opatření pro co nejvyšší úspěšnost. Víme, že tato technika je relativně nová a může být finančně náročnější, takže ne každý pěstitel má potřebné vybavení. Pokud však pracujete nebo jste si vybudovali vlastní laboratoř na tkáňovou kultivaci doma, podělte se o své zkušenosti s ostatními pěstiteli, zanechte komentář níže!

Odkazy

1. Plant Tissue Cultures. - Kärkönen, Anna & Santanen, Arja & Iwamoto, Kuninori & Fukuda, Hiroo. (2020). 
2. Nanotechnology and Plant Tissue Culture. - Tariq, Amina & Ilyas, Saiqa & Naz, Shagufta. (2020). 
3. Plant Tissue Culture Media, Recent Advances in Plant in vitro Culture. - Annarita Leva a Laura M. R. Rinaldi (2012).